Методы сборки плазмид
Сборка плазмид играет важнейшую роль в широком спектре молекулярно-биологических исследований и прикладных задач с использованием рекомбинантных молекул ДНК. Современные технологии позволяют собирать плазмиды с высокой точностью, скоростью и минимальными затратами. Ниже рассмотрим основные современные методы сборки плазмид, их преимущества и недостатки.
Метод лигирования с использованием рестриктаз
Классический метод, включающий гидролиз плазмиды и встройки (например, гена) с помощью рестриктаз, за которым следует лигирование ДНК-лигазой. Этот метод был основополагающим для развития генетической инженерии и остаётся популярным благодаря своей надёжности и простоте. Однако он имеет ряд ограничений, таких как необходимость наличия специфических сайтов рестрикции и относительная трудоёмкость [Green, M. R., & Sambrook, J. (2012). Molecular cloning. A Laboratory Manual. 4th edition, 448].
Сборка по Гибсону
Один из наиболее популярных современных методов сборки плазмид, разработанный Дэниелом Гибсоном [doi.org/10.1038/nmeth.1318]. Метод позволяет соединять несколько фрагментов ДНК одновременно в одной пробирке. Принцип основан на использовании экзонуклеаз, ДНК-полимераз и ДНК-лигаз, которые обеспечивают соединение фрагментов между собой. Основными преимуществами являются высокая точность, способность собирать большие конструкции и отсутствие необходимости в специфических сайтах рестрикции (рис. 1).
Метод лигирования с использованием рестриктаз
Классический метод, включающий гидролиз плазмиды и встройки (например, гена) с помощью рестриктаз, за которым следует лигирование ДНК-лигазой. Этот метод был основополагающим для развития генетической инженерии и остаётся популярным благодаря своей надёжности и простоте. Однако он имеет ряд ограничений, таких как необходимость наличия специфических сайтов рестрикции и относительная трудоёмкость [Green, M. R., & Sambrook, J. (2012). Molecular cloning. A Laboratory Manual. 4th edition, 448].
Сборка по Гибсону
Один из наиболее популярных современных методов сборки плазмид, разработанный Дэниелом Гибсоном [doi.org/10.1038/nmeth.1318]. Метод позволяет соединять несколько фрагментов ДНК одновременно в одной пробирке. Принцип основан на использовании экзонуклеаз, ДНК-полимераз и ДНК-лигаз, которые обеспечивают соединение фрагментов между собой. Основными преимуществами являются высокая точность, способность собирать большие конструкции и отсутствие необходимости в специфических сайтах рестрикции (рис. 1).
Рисунок 1. Схема сборки генетических конструкций по Гибсону [doi.org/10.1038/nmeth.1318].
Сборка методом Golden Gate
Этот метод основан на использовании рестриктаз типа IIS. Особенностью метода является формирование попарно одинаковых липких концов, что позволяет проводить одновременное лигирование. Golden Gate широко используется в современном клонировании [doi.org/10.1371/journal.pone.0003647].
Методы на основе сайт-специфической рекомбинации
Эти подходы основаны на использовании специфичных для бактерий сайтов рекомбинации (attP, attB, attL, attR). Система позволяет вставлять фрагменты ДНК в вектор благодаря рекомбинации с использованием нескольких вариантов фаговых рекомбиназ [doi.org/10.1101/gr.143000].
Также существует ещё целый ряд различных, более экзотических подходов, таких как методы с использованием ПЦР, бактериальных экстрактов и т. д. [doi.org/10.1093/nar/gkr1288, doi.org/10.1371/journal.pone.0006441].
Компания DUOX BIOTECHNOLOGIES использует все современные подходы для сборки генетических конструкций, выбирая наиболее оптимальные для каждой задачи. Это позволяет получать целевые молекулы в сжатые сроки. Для заказа генетических конструкций свяжитесь с нашими специалистами.
Этот метод основан на использовании рестриктаз типа IIS. Особенностью метода является формирование попарно одинаковых липких концов, что позволяет проводить одновременное лигирование. Golden Gate широко используется в современном клонировании [doi.org/10.1371/journal.pone.0003647].
Методы на основе сайт-специфической рекомбинации
Эти подходы основаны на использовании специфичных для бактерий сайтов рекомбинации (attP, attB, attL, attR). Система позволяет вставлять фрагменты ДНК в вектор благодаря рекомбинации с использованием нескольких вариантов фаговых рекомбиназ [doi.org/10.1101/gr.143000].
Также существует ещё целый ряд различных, более экзотических подходов, таких как методы с использованием ПЦР, бактериальных экстрактов и т. д. [doi.org/10.1093/nar/gkr1288, doi.org/10.1371/journal.pone.0006441].
Компания DUOX BIOTECHNOLOGIES использует все современные подходы для сборки генетических конструкций, выбирая наиболее оптимальные для каждой задачи. Это позволяет получать целевые молекулы в сжатые сроки. Для заказа генетических конструкций свяжитесь с нашими специалистами.